本製品で培養した初代ヒト肝細胞に対し、胆汁酸排泄トランスポーター（MRP2・BSEP）の各蛍光基質（CDFDA・Tauro-nor-THCA-24-DBD）を添加して、排泄機能評価を行いました。その結果、サンドイッチ培養法（従来法）と比べて、毛細胆管への蛍光基質の集積が多く観察されました。ciKIC® BCEM 1stおよびciKIC® BCEM 2ndを使用することで、高い胆汁酸排泄機能を長期にわたって維持することが可能です。

各蛍光基質を用いた胆汁酸排泄トランスポーターの排泄機能評価における蛍光顕微鏡像

細胞　　：BioIVT社Plateable primary human hepatocytes (Lot. WYZ)
培地　　：ciKIC® BCEM 1st（Day 0～3）およびciKIC® BCEM 2nd（Day 3～30）
　　　　　市販培地（Day 1, 8, 15は市販のECMを添加したもので培地交換）
培養容器：Ⅰ型コラーゲンコート96wellプレート
細胞密度：1×10⁵ cells/well（3×10⁵ cells/cm²）
培地量　：75 µL/well

ciKIC® BCEM 1st を初代ヒト肝細胞の播種時に使った場合、 播種2時間後の時点で接着・伸展している細胞が多く観察されました。ciKIC® BCEM 1st は、肝細胞の早期接着に有用であることが示唆されます。

播種直後の初代ヒト肝細胞の明視野顕微鏡像（播種培地の比較）

細胞　　：BioIVT社Plateable primary human hepatocytes (Lot. MNW)
培養容器：Ⅰ型コラーゲンコート24wellプレート
細胞密度：3.34×10⁵ cells/well（1.76×10⁵ cells/cm²）
　　　　　※毛細胆管形成の際は高密度での播種を推奨します（3×10⁵ cells/cm²）
培地量　：500 µL/well

ciKIC® BCEM 1stおよびciKIC® BCEM 2ndを使用することで、初代ヒト肝細胞を約1ヶ月間、培養可能です。

初代ヒト肝細胞の位相差顕微鏡像

細胞　　：BioIVT社Plateable primary human hepatocytes (Lot. WYZ)
培地　　：ciKIC® BCEM 1st（Day 0～3）およびciKIC® BCEM 2nd（Day 3～30）
培養容器：Ⅰ型コラーゲンコート96wellプレート
細胞密度：1×10⁵ cells/well（3×10⁵ cells/cm²）
培地量　：75 µL/well

● 本製品の調製方法
１．各基礎培地および各サプリメントを室温で融解ください。
２．各サプリメントを対応する基礎培地に添加ください（各サプリメント容器は一度洗いこみください）。
３．培地容器を転倒混和して調製完了です。その日から3週間以内を目安にご使用ください。
４．調製後の培地は、付属のアルミ袋に入れ、冷蔵保管してください。

● 試薬の準備
・ciKIC® BCEM 1st
・ciKIC® BCEM 2nd
・市販の初代ヒト肝細胞（凍結肝細胞）
・市販の肝細胞融解用培地（メーカー推奨品）
・Ⅰ型コラーゲンコート96wellプレート
・広口径チップ（細胞播種時に使用）

● 初代ヒト肝細胞でのプロトコール例
０．各培地は、使用前に37℃に加温しておきます。
１．火曜日をDay 0として、初代ヒト肝細胞をメーカー指定の方法・培地で融解します。
２．遠心後の細胞ペレットに対してciKIC® BCEM 1stを入れて細胞懸濁液を調製します。
３．Ⅰ型コラーゲンコート96wellプレートを用意し、細胞を播種します。
　　 推奨播種密度：1.0×10⁵ cells/well, 推奨培地量：75 µL（96wellプレート）
４．播種4時間後に全量培地交換します（75 µL/well）。
５．Day 1以降は、毎日培地交換を実施します（土日は不要）。
６．Day 3の培地交換でciKIC® BCEM 2ndに切り替えて培養を継続ください。
７．任意のタイミングでアッセイにご使用ください。

● TIPS
・Day 0で細胞懸濁液を均一化する際は、ピペッティング操作を極力避けて、転倒混和で対応ください。
・培地交換で培地を除去する際は、アスピレーターではなく、マイクロピペットを使ってください。
・プレートのレイアウトとして、プレート端側のwellは使用せずに滅菌済みのPBSまたは精製水を添加することを推奨します（培地蒸発の影響がデータのバラつきの要因となるため）。

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