シカジーニアス® 分子疫学解析POTキット（E. クロアカ complex用）

藤田医科大学の鈴木匡弘先生により開発されたPCR-based ORF Typing（POT法）は、マルチプレックスPCRを用いて複数の特定遺伝子を同時に増幅し、アガロース電気泳動で検出された増幅バンドパターンを解析し、菌体間の相同性を比較する方法です。
Enterobacter cloacae complex(ECC)は、E. cloacae の近縁の菌種の総称であり、その中の一部はカルバペネマーゼ産生腸内細菌目細菌(CPE)としても問題になっております。 本キットはECCを対象とし、主要菌種(E. hormaechei、E. asburiae like*¹、E. kobei like*² )の菌種同定、E. hormaechei 、E. asburiae like（大部分のE. asburiaeと一部のE. roggenkampii）の菌株識別・ST型推定、E. kobei like、その他ECCの簡易的なクローン同定が可能です。 本キットは、藤田医科大学と関東化学 生命科学研究所との共同研究の成果を用いて開発されました。

*1,*2 につきましては、後述の「解析方法」をご参照ください。

特徴

• 解析結果を数値化（POT値）することで、E. hormaechei、E. asburiae like（大部分のE.asburiaeと一部のE.roggenkampii）の菌株識別・ST型推定が可能
• E. kobei like（E.kobeiと一部のE.roggenkampii）、その他ECCは簡易的なクローン同定が可能
• E. hormaechei、E. asburiae likeにおいて、MLSTと同等の識別能

キット構成

	個別名称	容量	数量
試薬A	AptaTaq DNA Master（5×Conc.）*	240 μL	1 本
試薬B	PCRサプリメント	240 μL	1 本
試薬C	プライマーミックスα	120 μL	1 本
試薬D	プライマーミックスβ	120 μL	1 本
試薬E	ポジティブコントロール	240 μL	1 本
試薬F	6×ローディングバッファー	240 μL	1 本

＊AptaTaq DNA Master（5×Conc.）は、Roche Diagnostics K.K.の商品です。

操作手順

1. 分離した菌株を純培養
2. DNA抽出を行い、テンプレートDNAを調製
3. 2種類のマルチプレックスPCR
4. アガロースゲル電気泳動
5. バンドパターンの読み取り
6. POT値の算出
7. 各検体でのPOT値の比較解析

解析方法

左図：Reaction mixture 1、　右図：Reaction mixture 2


電気泳動のパターン
50: 50 bpラダー、P: ポジティブコントロール、1: ATCC^® 700323、2: ATCC^® 35030、3: ATCC^® 13047、
4～7: E. homraechei 分離株、8: E. asburiae 分離株、9: E. kobei 分離株、N: ネガティブコントロール

検出ORFの種類（ターゲット領域）とそのPCR増幅産物サイズ

	POT No.	増幅サイズ（bp）	ターゲット領域
Reaction mixture 1	PCR PC	668	ECC判定領域
	E. hormaechei PC	562	E. hormaechei 判定領域
	E. asburiae like PC	477	E. asburiae like 判定領域
	E. kobei like PC	399	E. kobei like判定領域
	POT 1-1	313	Genomic island-1
	POT 1-2	261	Genomic island-2
	POT 1-3	216	Genomic island-3
	POT 1-4	187	Genomic islet-1
	POT 1-5	163	Genomic island-4
	POT 1-6	141	Genomic island-5
	POT 1-7	116	Genomic island-6
	POT 1-8	93	bla IMP-1 group
Reaction mixture 2	E. hormaechei PC	562	E. hormaechei PC判定領域
	POT 2-1	410	Genomic island-7
	POT 2-2	344	Genomic islet-2
	POT 2-3	312	Genomic island-8
	POT 2-4	274	Genomic island-9
	POT 2-5	234	Genomic island-10
	POT 2-6	202	Genomic islet-3
	POT 2-7	163	Genomic island-11
	POT 2-8	144	Genomic island-12
	POT 2-9	118	Genomic island-13
	POT 2-10	97	Genomic island-14
	POT 2-11	82	Genomic island-15

1. 2つのマルチプレックスPCRの電気泳動結果からバンドパターンを読み取ります。
2. この電気泳動のバンドの有無の結果を用いて、POT値解析用の計算シートに二進法で入力し、2つのカテゴリーのPOT値を算出します。
   
   1. PCR PCが陽性の場合、その検体はEnterobacter cloacae complexであることが確認できます。
   2. POT1値が1000以上2000未満であればE. hormaechei、2000以上3000未満であればE. asburiae like (大部分のE. asburiaeと一部のE. roggenkampii)、3000以上であればE. kobei like (E. kobeiと一部のE. roggenkampii)、1000未満であればその他ECCと判定されます。
   3. POT値1が奇数の場合は、bla IMP-1 groupを保有していると推定できます。
   4. 試験株の菌種がE. hormaechei、E. asburiae likeの場合、POT1値がMLST解析によるST型と高い相関性を示します。
   5. POT1値とPOT2値を組み合わせて比較することで、菌株識別が可能となります。同一POT型（POT1値とPOT2値が同一）の分離株は、水平伝播の可能性が疑われます。
   6. 試験株の菌種がE. kobei like、その他ECCの場合、POT1値とMLST解析との相関性は低く、同じST型の菌株でも異なるPOT1値またはPOT型になることや、異なるST型の菌株でも同じPOT1値またはPOT型を示す場合があります。

解析結果

カテゴリー	サンプル番号
	1	2	3	4	5	6
POT 1	1131	1131	2093	1255	1239	3001
POT 2	509	2029	1872	37	943	429

製品一覧

製品番号	製品名	保存温度	規格	包装	詳細
08376-97	ｼｶｼﾞｰﾆｱｽ 分子疫学解析POTｷｯﾄ(E.ｸﾛｱｶ complex用)	冷凍	分子生物学用	1pack(30回分)
08178-96	ｼｶｼﾞｰﾆｱｽ DNA抽出試薬	冷蔵	分子生物学用	1pack(120回分)

★上記の他に必要な機材・試薬などがございますので、弊社営業所もしくは販売店へお問合せください。
★本キットは、藤田医科大学から特許許諾を得て製造をしております。他メーカーの商品に関するライセンスについては、各メーカーにご確認ください。
★製品の仕様は、製品の改良のため変更する場合がございます。あらかじめご了承ください。
・「法律」,「SDS」,「在庫」など詳細情報は、[Cica-Webで確認]ボタンをクリックいただきご確認いただけます。
・試薬のご購入とご使用に際して

パンフレット

シカジーニアス® 分子疫学解析POTキット（E. クロアカ complex用）

取扱説明書

シカジーニアス®分子疫学解析POTキット（E. クロアカ complex用）

計算シート（ZIPファイル、エクセル）

POT値解析用エクセルシート（ZIPファイル)

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製品情報